Das vorliegende Buch gibt eine Einführung in folgende moderne Verfahren der Proteinanalytik: Aminosäure-Sequenzanalyse, Prinzipien und Techniken der Chromatographie und Elektrophorese, Massenspektrometrie, UV/Vis-, CD-, IR-, Raman-, NMR- und ESR-Spektroskopie, Lichtstreuung, Sedimentationsanalyse, immun- und biochemische Verfahren, datenbankgestützte Strukturvorhersagen, chemische Modifizierung von Proteinen. Es verbindet eine abgerundete Darstellung von Theorie, Arbeitsmethoden und Meßverfahren mit einer kritischen Wertung der Möglichkeiten und Grenzen ihres Einsatzes. Es wendet sich an Studenten der Biochemie und verwandter Gebiete und alle in den Biowissenschaften Tätige.

1 Was will die Proteinanalytik? Eine Einführung

2 Chromatographie
2.1 Gelfiltration
2.2 Ionenaustauschchromatographie (IEC)
2.3 Hydrophobe Chromatographie und Umkehrphasen- Chromatographie
2.4 Metallchelat-, kovalente und thiophile Chromatographie
2.5 Affinitätschromatographie
2.6 Hochleistungs-Flüssigchromatographie
Literatur
3 Aminosäure-Sequenzanalyse und Massenspektrometrie
3.1 N-terminale Aminosäure-Sequenzanalyse
3.2 C-terminale Aminosäure-Sequenzanalyse
3.3 Peptidmapping
3.4 Massenspektrometrie
Literatur
4 Optische Spektroskopie
4.1 Physikalische Grundlagen
4.1.1 Welle-Teilchen-Dualismus des Lichtes
4.1.1.1 Licht als elektromagnetische Welle
4.1.1.2 Korpuskel-Charakter des Lichtes
4.1.2 Anregung von elektronischen Übergängen, Schwingungen und Rotationen
4.1.2.1 Anregungsbedingungen
4.1.2.2 Elektronenanregung
4.1.2.3 Anregung von Schwingungen
4.1.3 Absorptionsgesetz
4.2 Spektrometer
4.3 Absorptionsspektroskopie im ultravioletten und sichtbaren Bereich des Lichtes
4.3.1 Einleitung
4.3.2 Absorptionsspektren von Proteinen im ultravioletten und sichtbaren Bereich des Lichtes
4.3.3 Differenzspektroskopie
4.3.4 Konzentrationsbestimmung von Proteinen aus der Absorption bei 280 nm
4.3.5 Lineardichroismus
4.4 Circulardichroismus (CD)
4.4.1 Grundlagen
4.4.1.1 Polarisation des Lichtes
4.4.1.2 Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus
4.4.2 Aufbau eines Circulardichrographen
4.4.3 CD-Spektren von Proteinen
4.4.3.1 Analyse der Sekundärstruktur
4.4.3.2 Analyse von Konformationsänderungen
4.5 Fluoreszenz-Spektroskopie
4.5.1 Grundlagen
4.5.1.1 Absorption und Emission
4.5.1.2 Quantenausbeute
4.5.1.3 Strahlungslose Desaktivierung
4.5.1.4 Fluoreszenz-Lebensdauer ?F und Lebensdauer ? des angeregten Zustandes
4.5.2 Bestimmung von Fluorophor-Abständen aus dem Energietransfer (FöRSTER-Transfer)
4.5.3 Fluoreszenz-Polarisation
4.5.4 Zeitaufgelöste Fluoreszenz
4.5.5 Fluoreszenzspektren von Proteinen
4.5.6 Fluoreszenzsonden in der Proteinanalytik
4.6 Infrarot-spektroskopische Untersuchungen an Proteinen
4.6.1 Einleitung
4.6.2 Amidschwingungen und Proteinkonformation
4.6.3 FOURIER-Transform-Infrarot (FTIR)-Spektrometer
4.6.4 Messung der IR-Spektren von Proteinen
4.6.5 Auswertung der IR-Spektren von Proteinen
4.7 RAMAN-Spektroskopie
4.7.1 Einleitung
4.7.2 Meßtechnik
4.7.3 RAMAN-Spektren von Proteinen
4.7.4 Resonanz-RAMAN (RR)-Spektroskopie von Proteinen
4.7.5 FOURIER-Transform-RAMAN-Spektroskopie im nahen Infrarot-Bereich
4.7.6 Oberflächenverstärkte RAMAN-Spektroskopie (SERS und SERRS)
Literatur
5 NMR-Spektroskopie - Strukturaufklärung von Peptiden und Proteinen in Lösung
5.1 Physikalische und methodische Grundlagen
5.2 Das NMR-Spektrum
5.2.1 Die Chemische Verschiebung
5.2.2 Kopplungskonstante J
5.2.3 Integrale Signalintensität
5.2.4 Linienbreite
5.2.5 Relaxationszeiten T1 und T2
5.2.6 Kern (Nuclear)-OVERHAUSER-Effekt (NOE)
5.3 Informationen aus NMR-Parametern zur Peptid- und Proteinstruktur
5.4 Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
5.5 Zuordnungsstrategien für Peptid- und Proteinstrukturen mittels mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie und Molecular Modelling
Literatur
6 ESR-Spektroskopie - eine Analysenmethode für paramagnetische Zentren in Proteinen
6.1 Einleitung
6.2 Grundlagen der ESR
6.2.1 Prinzip der ESR
6.2.2 ESR-Spektrenparameter
6.2.2.1 g-Faktor
6.2.2.2 Hyperfeinstruktur
6.2.2.3 Linienbreiten (Relaxationszeiten)
6.2.2.4 Intensität
6.2.3 ESR-Spektrometer (Prinzipieller Aufbau)
6.2.3.1 Probentemperierung und Küvettenform (X-Band-ESR)
6.2.4 Spezialtechniken der ESR
6.2.4.1 Verbesserung der spektralen Auflösung
6.2.4.2 Techniken zur Analyse kurzlebiger Radikale
6.2.4.3 Räumliche Auflösung (Imaging)
6.3 Paramagnetische Zentren in Proteinen
6.3.1 Metallkomplexe im aktiven Zentrum von Enzymen
6.3.2 Natürliche Radikale und Enzymfunktion
6.3.2.1 Proteingebundene Aminosäureradikale
6.3.2.2 Radikale bei Enzymreaktionen (Redoxenzyme)
6.3.3 Radikale als Defekte in bestrahlten Proteinen
6.3.4 Radikalische Spinsonden - Konformationsdynamik von Proteinen
6.3.4.1 Prinzip der Spinmarkierung
6.3.4.2 Kovalente Proteinmarkierung
6.3.4.3 Nichtkovalente Proteinmarkierung
6.3.4.4 Markierte Effektormoleküle
Literatur
7 Lichtstreuung und Sedimentationsanalyse
7.1 Einleitung
7.2 Lichtstreuung
7.2.1 Grundlagen der klassischen Lichtstreuung
7.3 Dynamische Lichtstreuung
7.3.1 Grundlagen der dynamischen Lichtstreuung
7.4 Sedimentationsverhalten von Proteinen
7.4.1 Experimentelle Bestimmung der Sedimentationskoeffizienten mit der analytischen Ultrazentrifuge
7.4.2 Aktive Enzymsedimentation
7.4.3 Nachweis einer molekularen Heterogenität
7.4.4 s-M-Beziehung
7.4.5 Flotation
7.5 Diffusion
7.5.1 Experimentelle Bestimmung der Diffusionskoeffizienten
7.5.1.1 Analyse integraler Konzentrationsverteilungskurven
7.5.1.2 Analyse differentieller Konzentrations- verteilungskurven
7.6 Das partielle spezifische Volumen
7.6.1 Wägemethoden
7.6.2 Schwingungsmethoden
7.6.3 Zentrifugationsmethoden
7.6.4 Rechnerische Bestimmung
7.7 Trennleistung der analytischen Ultrazentrifugen
7.8 Sedimentationsgleichgewichts-Experimente
7.8.1 Technik des Sedimentationsgleichgewichts- Experiments
7.8.2 Auswertung von Sedimentationsexperimenten
7.9 Berechnung weiterer Molekülparameter aus den Primärdaten
7.9.1 Molekülgestalt
7.9.2 Das Molekülvolumen
7.9.3 Der Virialkoeffizient
7.9.4 Konformationsänderungen
7.9.5 Assoziationsgleichgewichte
Literatur
8 Thermodynamische Untersuchungen an Proteinen
8.1 Grundgleichungen
8.2 Kalorimetrie
8.2.1 Mischungs-und Titrationskalorimeter
8.2.2 Scanning-Kalorimetrie
8.3 Ligandenbindung
8.4 Proteinfaltung und Proteinstabilität
8.5 Weitere analytische Anwendungen thermodynamischer Methoden
8.5.1 Der Enzymthermistor..
8.5.2 Die kalorimetrische Reinheitsanalyse von Lipiden
8.5.3 Kalorimetrie an lebenden Mikroorganismen
Literatur
9 Bioinformatik: Proteinsequenzen und Sekundärstruktur-Vorhersagen
9.1 Verfahren von CHOU und FASMAN
9.2 Die GOR-Methode
9.3 Die SIMPA-Methode von GARNIER und LEVIN
9.4 Die Verfahren von LIM sowie von FINKELSTEIN und PTITSYN
9.5 Grenzen einer Generation von Vorhersageverfahren
9.6 Datenbanken und Forschungsnetze
9.7 Ähnlichkeit von Sequenzen und Alignments
9.8 Strukturvorhersage durch Sequenzhomologie
9.9 Die Methode von BENNER und GERLOFF
9.10 Das PHD-Verfahren von ROST und SANDER
9.11 Vorhersagen über die Sekundär struktur hinaus
Literatur
10 Markierungsmethoden
10.1 Kovalente Markierung
10.1.1 Radioaktive Markierung
10.1.2 Nichtradioaktive Markierung
10.1.2.1 Das Biotin-(Strept-)Avidin-System
10.1.2.2 Markierungen mit Haptenen
10.1.2.3 Markierungen mit Fluoreszenz-und Spinmarkern
10.1.2.4 Affinitätsmarkierung
10.1.2.5 Enzym-Konjugate
10.1.2.6 Quervernetzung von Proteinen (cross-linking)
10.2 Adsorptive und biospezifische, nichtkovalente Markierung
Literatur
11 Elektrophoretische Techniken
11.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
11.1.1 SDS-PAGE
11.1.2 Nichtdenaturierende PAGE und Affinitätselektrophorese
11.2 Agarose-Gelelektrophorese und Immunelektrophorese
11.3 Isoelektrische Fokussierung und zweidimensionale Elektrophorese
11.3.1 Isoelektrische Fokussierung
11.3.2 Zweidimensionale Elektrophorese
11.4 Nachweisverfahren in der Elektrophorese
11.4.1 Färbemethoden
11.4.2 Autoradiographic und Chemoluminiszenz
11.4.3 Zymogramme
11.5 Blottingtechniken
11.6 Kapillarelektrophorese
Literatur
12 Immunchemie
12.1 Einleitung. Klassifizierung und Aufbau von Antikörpern
12.2 Quantitative Proteinbestimmungen
12.3 Antikörpergewinnung
12.3.1 Immunisierung
12.3.2 Polyklonale Antikörper
12.3.3 Monoklonale Antikörper
12.3.4. Phagen-Display-Technik
12.4 Antikörper-Reinigung und-Fragmentierung
12.5. Bispezifische Antikörper
12.6. Immunoblotting-Techniken
12.7 Immunoassays
12.7.1 Heterogene Immunoassays
12.7.2 Homogene Immunoassays
12.7.3 Immunosensoren
12.8 Epitopmapping
12.9 Immunaffinitätschromatographie und Immunpräzipitation
12.10 Katalytische Antikörper (Abzyme)
Literatur
13 Biochemische Methoden: Rezeptoren und Enzyme
13.1 Charakterisierung von Rezeptoren (Rezeptor-Bindungstests)
13.2 Bestimmung von Enzym-Parametern
Literatur.